moyens d'essais

Exposition de cultures cellulaires aux aérosols complexes

Le CERTAM et l'INSERM U644 travaillent en partenariat depuis 1996 sur l'impact biologique des atmosphères complexesAu cours de ces années de recherche, différents modèles d'exposition de matériel biologique ont pu être élaborés et un modèle de culture cellulaire a été développé au cours du programme européen MAAPHRI (Multidisciplinary Approach to Airborne Pollutant Health Related Issues).

Modèle d'exposition aux aérosols complexes par phénomènes diffusifs

L'aérosol traverse la chambre d'exposition via l'entrée centrale et diffuse au-dessus des plaques de culture.

Les cellules adhérentes sont cultivés sur support micro-poreux permettant une exposition directe du pôle apical aux aérosols ainsi qu'une nutrition par le pôle basal.

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L'utilisation combinée de plusieurs chambres d'exposition et de différentes souches cellulaires permet de réaliser un nombre d'expérimentation conséquent:

• Différentes dilutions de l'atmosphère en parallèle
• Surface de culture étendue pour des applications monocellulaires
• Test de différentes souches cellulaires ou de différents traitements en parallèle

Laboratoire de culture cellulaire.
Le CERTAM dispose d'un mini-laboratoire permettant d'effectuer les opérations courantes de culture cellulaire.

Equipement:

• Hotte à flux laminaire vertical
• Etuve de culture cellulaire
• Centrifugeuse
• Bain-Marie
• Azote liquide pour les opérations de congélation

Souches couramment utilisées au CERTAM

• Cellules transformées avec plasmide reporter pGL3 associé à différents promoteurs d'interleukines
• Cellules épithéliales alvéolaires pulmonaires: lignée A549
• Cellules lymphoblastiques T: lignée Jurkat

Modèle de culture organotypique exposé aux atmosphères complexes

Le partenariat entre le CERTAM et l'INSERM a permis de développer un modèle de culture organotypique de tranche de poumon.

Ce modèle permet de conserver intact les structures des alvéoles pulmonaires ainsi que les interactions entre les différents types cellulaires les constituant.

Obtention des tranches de poumon

• Les tranches obtenues à l'aide d'un Slicer Vitron ont une épaisseur de 150µm et un diamètre de 8mm.
• Les échantillons biologiques sont exposés aux atmosphères diluées d'émission moteur dans les incubateurs pendant 3 heures.

Evaluation Biologique

• Evaluation du stress oxydant: dosage du Glutathion, Superoxyde dismutase, Catalase, Glutathion peroxydase.
• Evaluation des atteintes à l'ADN: dosage des nucléosomes libres, caspase, échelles d'ADN.
• Evaluation de la viabilité cellulaire: dosage d'ATP/ADP, relargage de LDH.
• Evaluation de l'inflammation: dosage ELISA de cytokines pro- et anti-inflammatoires.
• Immunohistochimie: marquage de protéines membranaires (ICAM-1), marquage TUNEL, marquage de la 8-déhydroxy-guanosine.
• Mesure des radicaux libres de la phase gazeuse par Résonance Paramagnétique Electronique.

Publications

• Development of a new in vitro system for continuous in vitro exposure of lung tissue to complex atmospheres: Application to diesel exhaust toxicology
• Toxicity of diesel engine exhausts in an in vitro model of lung slices in biphasic organotypic culture: induction of a proinflammatory and apoptotic response
• Biphasic culture of rat lung slices for pharmacotoxicological evaluation of complex atmospheres

Contact: david.preterre@certam-rouen.com